Афлатоксины в томатной пасте

Ключевые слова:

ВЭТСХ, количественная оценка, денситометрия, иммуноаффинные колонки, афлатоксин B1, афлатоксин G1, афлатоксин B2, афлатоксин G2, экстракт томатов

Введение:

Афлатоксины - это природные микотоксины, продуцируемые грибами рода Aspergillus. Высокие температуры и влажность способствуют появлению плесени и, следовательно, образованию афлатоксинов. Заражение сельскохозяйственных культур, орехов, сушеных фруктов/овощей, высушеных лекарственных растений и молока является довольно распространенным явлением. Наличие афлатоксинов в пище и кормах должно контролироваться, так как афлатоксины являются канцерогенами.

Обзор:

Этот метод предназначен для количественного определения афлатоксинов B1, G1, B2, и G2 в экстракте томатов, по USP глава <561> Articles of Botanical Origin of USP 35, содержание афлатоксина В1 должно быть не выше 5 мкг/кг, а сумма B1, G1, B2, и G2 не выше 20 мкг/кг. Хроматографию проводят на ВЭТСХ пластинах HPTLC по методу II.

Оборудование:

Automatic TLC Sampler 4 или Linomat 5, Automatic Developing Chamber ADC 2 или Twin Trough Chamber 20 x 10 cm, TLC Visualizer, TLC Scanner и ПО visionCATS.

Пробы:

Перенесите 5 г репрезентативного порошкообразного образца, точно взвешенного, в колбу со стеклянной пробкой. Добавьте 20 мл смеси метанола и воды (17:3). Встряхивайте колбу не менее 30 минут и профильтруйте. Отбросьте первые 5 мл фильтрата и соберите следующую порцию в 4 мл. Перенесите фильтрат в делительную воронку. Добавьте 4 мл раствора хлорида натрия (5 г хлорида натрия в 50 мл воды) и 2,5 мл гексана и встряхивайте в течение 1 минуты. Дайте слоям отделиться и перенесите нижний водный слой во вторую делительную воронку. Экстрагируйте водный слой в делительной воронке дважды, каждый раз с 2,5 мл хлористого метилена, встряхивая в течение 1 минуты. Дайте слоям отделиться каждый раз, отделите Нижний органический слой и соберите объединенные органические слои в коническую колбу объемом 50 мл.

Выпарьте растворитель на водяной бане. Перенесите оставшийся экстракт в соответствующую пробирку и выпарьте досуха на водяной бане. Дайте пробе остыть. Растворите полученный выше остаток в 200 мкл ацетонитрила. Если в пробе остаются примеси, выполните процедуру очистки в соответствии с указаниями с помощью иммуноаффинной колонки (IAC).

Очистка проб с помощью иммуноаффинной колонки (IAC)
Остаток вышеуказанного раствора пробы растворяют в 5 мл смеси метанола и воды (60: 40) и затем разбавляют 5 мл воды.
Этот экстракт наносят на кондиционированную IAC колонку. Колонку дважды промывают 10 мл фосфатным буфером*, а элюирование проводят медленно 2 мл метанола. Элюат упаривают в токе азота и остаток перерастворяют в 200 мкл ацетонитрила.

*Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS): приготовьте 10 мм фосфатный буферный раствор, содержащий 0,138 м хлорида натрия и 0,0027 м хлорида калия в воде, и отрегулируйте с помощью 2 м гидроксида натрия до рН 7,4. Соответствующей порошковой смеси производится компанией Sigma как PBS с номером P-3813

Подготовка иммуноаффиной колонки
Перед кондиционирование колонку выдерживают при комнатной температуре. Для кондиционирования на колонку наносят 10 мл раствора фосфатного буфера для каждой колонки с расходом от 2 до 3 мл/мин самотеком. Оставьте 0.5 мл буфера на верху колонки до момента нанесения образца.

В данной публикации для экстракта томатов использовали IAC колонки RBiopharm.

Стандарты:

Растворы стандартов с концентрацией 0.05 мкг/мл для афлатоксинов B1 и G1 и 0.01 мкг/мл для афлатоксинов B2 и G2 в смеси в растворе хлороформ - ацетонитрил (9.8:0.2).

Хроматография:

• Пластина: HPTLC Si 60 F254 20 x 10 см (Merck).
• Нанесение: 10 мкл для испытуемых и 2, 5, 7.5 и 10 мкл для стандартов зонами шириной 8 мм, 8 мм от нижнего края пластины.
• ПФ: Хлороформ, ацетон, вода (140:20:0.3) (об/об/об)
• Элюирование: 20 x 10 см стеклянная камера Twin Trough Chamber (ADC2), насыщение 20 мин (с фильтр.бумагой), 10 мл для элюирования и 20 мл для насыщения, влажность 33 %отн. (насыщ. р-р MgCl2).
• Дистанция фронта: 70 мм от нижнего края.
• Сушка: 5 мин в потоке холодного воздуха.
• Дериватизация: дополнительно: иммерсия (время 0, скорость 5) парафин в нгексане (2:3), сушка на воздухе
• Оценка: В режиме УФ 366°nm.

Денситометрия:

С помощью CAMAG TLC Scanner и ПО visionCATS в режиме флуоресценции 366/>400 нм с ртутной лампой; расчет через площадь пика, линейная калибровка.

Рис. 1 Снимок пластины в УФ 366 nm 

Рис. 2 Денситограмма стандартов G2, G1, B2, и B1

Рис. 3 Денситограмма пробы экстрактов томатов (черная) и пробы с добавкой 5 ppb афлатоксинов B1 и G1 (зеленая)

Рис. 4 Калибровочная кривая для афлатоксина B1 на 366 нм
Расчет через площадь y=-113.971+1.931x+-0.001x2 r=0.99998 sdv=0.84 %

Литература:

USP 35-2: Test for Aflatoxins” of chapter <561> Articles of Botanical Origin.

Камеры Twin Trough Chamber

Документирование и оценка с помощью TLC Visualizer

Полуавтоматический аппликатор Linomat 5

Автоматическая камера ADC 2