Профессор Эви Костенис возглавляет исследовательскую группу в Институте фармацевтической биологии университета Бонна, которая утвердила тест-систему «без меток» для скрининга фармацевтически активных веществ. Она основана на оптических биосенсорах и с большим успехом применяется в многочисленных исследовательских проектах. Для обеспечения точного контроля температуры во время проведения анализов используется инкубатор IPP с охлаждением на основе элементов Пельтье и инкубатор I, оба производства компании Memmert.
Рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR), насчитывающие около 1000 видов, представляют собой самое большое семейство белков. Исследования этого семейства суперпротеинов были отмечены двумя Нобелевскими премиями, в 1994 году и в 2012 году, что отражает их важность для межклеточной коммуникации. Точный принцип работы многих физиологических процессов в животных и растительных организмах долгие годы оставался секретом, и по сей день биологи, химики и фармакологи работают над тем, чтобы воспроизвести эти молекулярные механизмы с максимальной точностью.
Межклеточные и внутриклеточные преобразователи сигналов: рецепторы, сопряженные с G-белками
Многие вещества-посредники, такие как гормоны, нейротрансмиттеры и феромоны, не проникают в клетки. Вместо этого они закрепляются на специализированных рецепторах на внешней стороне клеточной мембраны. В человеческом организме насчитывается около 1000 различных рецепторов, связанных с G-белками, которые передают сигналы внутрь клеток, вызывая различные эффекты. Поэтому они представляют собой один из самых изучаемых объектов в фармакологии. Многие лекарственные препараты, такие как бета-блокаторы, антигистаминные или нейролептические средства, активируются с помощью рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), и изучение дальнейших механизмов воздействия открывает безграничные терапевтические возможности. «GPCR и связанные с ними G-белки участвуют во многих физиологических процессах, например, в регуляции артериального давления, тонуса мышц дыхательных путей, движения клеток, метаболизма и клеточной пролиферации».
Возрастающая актуальность клеточного анализа
Исследовательская группа под руководством профессора Костениса в Институте фармацевтической биологии Боннского университета в основном изучает рецепторы, сопряженные с G-белками, и внутриклеточные сигнальные пути и поэтому также фокусируется на определении фармацевтически активных веществ, которые оказывают влияние на GPCR и семейство гетеротримерных G-белков.
С целью анализа таких веществ, которые в конечном итоге используются как при разработке фармацевтических препаратов, так и в качестве важных инструментов для расшифровки сложных сигнальных процессов, необходимо сначала зарегистрировать процессы внутриклеточной передачи сигнала. Это можно сделать путем регистрации отдельных событий внутри клеток, зачастую с использованием молекул, окрашенных химическими контрастными веществами (например, флуоресцентными веществами), и лизиса клеток, несущих рецепторы. Однако всегда существует риск, что сами окрашенные молекулы влияют на взаимодействие, которое должно быть зарегистрировано.
По этой причине исследовательская группа Костениса также работала с применением методов анализа без контрастных веществ, известных как «анализ без меток», таких как регистрация динамического перераспределения массы (DMR). Эта технология позволяет регистрировать минимальные изменения оптической плотности клеток, происходящие при активации GPCR (Schröder et.al. 2010, 2011). Метод DMR является целостной альтернативой для регистрации сложных сигнальных процессов в интактных живых клетках. Особенностью этого метода является возможность регистрировать все четыре основных сигнальных пути GPCR, что в противном случае потребовало бы использования отдельных аналитических платформ для каждого из них.
Таким образом, уже на ранней стадии процесса фармакологических исследований можно получить сложные данные, основанные на комплексном изучении клеток в режиме реального времени. Это метод максимально приближен к серии тестов in-vivo, потенциально способствуя снижению потребности в испытаниях на животных. Кроме того, метод DMR также подходит для высокопроизводительного скрининга (HTS) и поэтому представляет большой интерес для фармацевтической промышленности, когда речь идет о тестировании библиотек из сотен тысяч веществ для выбранных целевых структур.
Клеточный анализ и обнаружение «без меток»
Возможность измерения физиологических клеточных процессов без применения контрастных веществ и в реальном времени, то есть без необходимости учета нежелательного воздействия люминесцентных или радиоактивных веществ, а также целостная регистрация – основные преимущества этих новых технологий скрининга для современных исследований. Институт фармацевтической биологии использует систему Epic® BT компании Corning для безметочного обнаружения G-белков. Измерительная система состоит из широкополосного источника света, оптического биосенсора, встроенного в 384-луночный микропланшет, и детектора. Когда поляризованный широкополосный свет попадает на биосенсор, он отражается в виде волны определенной длины. При добавлении вещества и активации сигнальных путей распределение клеточной массы меняется, изменяя длину волны отраженного света. Результаты измерения показывают изменение длины волны отраженного света, что коррелирует с изменением оптической плотности вблизи биосенсора. Эта технология обычно используется, например, для количественной оценки влияния различных концентраций определенных веществ с помощью кривых концентрация/эффект.
Регулирование температуры Corning Epic® BT в инкубаторе
Измерительная установка Института состоит из двух инкубатора Memmert. Небольшой аппарат-робот, доведенный до нужной температуры в инкубаторе Memmert IN160, заполняет лунки с помощью дозатора. Измерения DMR чувствительны к температуре, поэтому температура системы Corning Epic® BT доводится строго до 28 °C или 37 °C в инкубаторе IPP110 с охлаждением Пельтье. Способность инкубатора к охлаждению позволяет, с одной стороны, устанавливать температуру ниже текущей комнатной, а с другой стороны, обеспечивает более быстрый переход между различными последующими измерениями при разных температурах.
Охлаждаемый инкубатор IPP отличается чрезвычайно низким уровнем шума и почти полным отсутствием вибрации, что, по мнению доктора Ральфа Шрёдера и ученых университета Бонна, стало главным фактором успеха при валидации системы тестирования. Измерения проводятся при постоянной температуре в течение 60-90 минут. После измерения базового уровня сигнала необходимо добавить вещества, используемые для измерения реакций, и потому дверцу инкубатора приходится открыть примерно на 5 секунд. Помимо стабильности температуры, обеспечиваемой этим устройством, исследователи института также высоко оценили быстрое время восстановления температуры после открытия и закрытия дверцы. Для предотвращения радикальных изменений температуры была установлена стеклянная внутренняя дверь и специальная дверца меньшего размера (дверь в двери) (примерно 120 x 160 мм), которые могут открываться по отдельности, сводя колебания температуры к минимуму.
Текст этой статьи в значительной степени основан на информации, предоставленной Институтом фармацевтической биологии Университета Бонна. Компания AtmoSAFE благодарит доктора Ральфа Шрёдера и компанию Corning в Висбадене за любезное сотрудничество. Университет Бонна выбрал инкубаторы, воспользовавшись дружеским и практичным советом г-на Т. Гейера.
Добавить комментарий