Клеточный анализ в инкубаторе. Температурный контроль системы скрининговых испытаний - Gluvexlab

Клеточный анализ в инкубаторе. Температурный контроль системы скрининговых испытаний - Gluvexlab

Клеточный анализ в инкубаторе. Температурный контроль системы скрининговых испытаний

Клеточный анализ в инкубаторе. Температурный контроль системы скрининговых испытаний

Клеточный анализ в инкубаторе. Температурный контроль системы скрининговых испытаний

Клеточный анализ в инкубаторе. Температурный контроль системы скрининговых испытаний

Профессор Эви Костенис — руководитель исследовательской группы Боннского института фармацевтической биологии, которая утвердила систему скрининг-тестов для фармацевтически активных веществ на основе оптических биосенсоров и теперь с большим успехом использует ее для многочисленных исследовательских проектов. В своей работе исследовательская группа использует инкубатор IPP с охлаждением Пельтье и инкубатор I от компании Memmert. Такое оборудование обеспечивает точный контроль температуры во время анализов.

Имея около 1000 составляющих, рецепторы, связанные с G-белком, представляют собой наибольшее семейство белков. Исследования этого семейства суперпротеинов были отмечены двумя Нобелевскими премиями: в 1994 году и в 2012 году, что свидетельствует о том, насколько это важно. Точный способ работы многих физиологических процессов в животных и растительных организмах был хорошо хранящимся секретом на протяжении многих лет, и по сей день биологи, химики и фармакологи все еще работают над воспроизведением этих молекулярных механизмов с максимально возможной точностью.

Меж- и внутриклеточные преобразователи сигналов: рецепторы, связанные с G-белком

Многие вещества-посредники (мессенджеры), такие как гормоны, нейротрансмиттеры и феромоны, не попадают в клетки. Вместо этого они фиксируются на узкоспециализированных рецепторах снаружи клеточной мембраны. В организме человека около 1000 различных рецепторов, связанных с G-белком. Они передают сигналы внутрь клеток, вызывая различные эффекты, поэтому являются одними из наиболее интересных для исследований структур в фармакологии.

Многие фармацевтические препараты, такие как бета-блокаторы, антигистаминные препараты или нейролептики, активируются с помощью рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), и исследование дополнительных механизмов действия открывает огромные терапевтические возможности. GPCR и связанные с ними G-белки участвуют во многих физиологических эффектах, например, в регуляции артериального давления, мышечном тонусе дыхательных путей, движении клеток, метаболизме и пролиферации клеток.

Диаграмма цикла активации G-белков с рецепторами, связанными с G-белком


Повышение релевантности клеточных анализов

Исследовательская группа, возглавляемая профессором Костенисом из Боннского института фармацевтической биологии, в основном занимается исследованием рецепторов, сопряженных с G-белком и внутриклеточными сигнальными путями.

Также группа занимается определением фармацевтически активных веществ, которые влияют на GPCR и семейство гетеротримерных G-белков. При анализе таких веществ, которые важны как для разработки фармацевтических продуктов, так и в качестве важных инструментов для декодирования сложных процессов передачи сигналов, сначала должны регистрироваться процессы внутриклеточной передачи сигнала. Это может быть сделано путем регистрации отдельных событий внутри клеток, часто с использованием молекул, погибших из-за химических контрастирующих агентов (например, флуоресцентных веществ), и в результате лизиса клеток, несущих рецептор.

Однако всегда существует риск того, что умершие молекулы сами повлияют на взаимодействие, которое должно быть зарегистрировано. По этой причине исследовательская группа Костениса также работала с методами анализа без контрастного вещества, известными как «анализы без меток», такие как динамическое перераспределение массы без меток (DMR). Эта технология регистрирует минимальные изменения оптической плотности клеток, которые происходят при активации GPCR.

Метод DMR представляет собой целостную альтернативу регистрации сложных сигнальных процессов в интактных живых клетках. Что делает его особенным, так это то, что можно регистрировать все четыре основных пути передачи сигналов GPCR. Если не использовать этот метод, для каждого из путей требуется отдельная аналитическая платформа.

Сигналы характерные для DMR после активации рецепторов

Таким образом, в режиме реального времени можно получить сложные данные на основе клеток уже на ранней стадии процесса фармакологических исследований. Этот метод наиболее близок к серии испытаний in vivo (внутри живого организма), потенциально способствуя снижению потребности в тестировании на животных. Кроме того, метод DMR также подходит для высокопроизводительного скрининга (HTS) и поэтому представляет большой интерес для фармацевтической промышленности, когда речь идет о тестировании сотен тысяч веществ для выбранных целевых структур.

Клеточный анализ и обнаружение «без меток»

Возможность измерения физиологических клеточных процессов без флуоресцентных меток и в режиме реального времени, то есть без нежелательной реакции люминесцентных или радиоактивных веществ, и целостная регистрация являются основными преимуществами этих новых технологий скрининга.

Институт фармацевтической биологии использует систему Epic® BT от Corning для безметочного обнаружения G-белков. Измерительная система состоит из:

  • широкополосного источника света
  • оптического биосенсора, встроенного в 384-луночный планшет
  • детектора

Когда поляризованный широкополосный свет поступает в биосенсор, он отражается с определенной длиной волны. Если добавляется вещество и активируются сигнальные пути, распределение клеточной массы изменяется, изменяется длина волны отраженного света. Результаты измерений демонстрируют изменение длины волны света, отражая изменение оптической плотности вблизи биосенсора. Это обычно используется, например, для количественного определения влияния различных концентраций определенных веществ с помощью кривых концентрация/эффект.

Регулирование температуры Corning Epic® BT в инкубаторе

Измерительная установка Института состоит из двух инкубаторов Memmert. Маленький роботизированный элемент, который доводится до необходимой температуры в инкубаторе Memmert IN160, пронизывает лунки. Измерения DMR чувствительны к температуре, поэтому температура системы Corning Epic® BT доводится строго до 28°C или 37°C в инкубаторе с охлаждением Peliter IPP110. Охлаждающая способность инкубатора позволяет выбирать температуры ниже текущей комнатной с одной стороны, а с другой — обеспечивает более быстрый переход между различными последующими измерениями при разных температурах.

Инкубатор на основе эффекта Пельтье IPP110
Инкубатор на основе эффекта Пельтье IPP110

Охлаждаемый инкубатор IPP отличается особой бесшумностью и почти полным отсутствием вибраций, что, по словам доктора Ральфа Шредера и университета Бонна, стало главным фактором успеха для проверки системы тестирования.

Измерения проводятся при постоянной температуре в течение 60-90 минут. После измерения базового уровня сигнала необходимо добавить вещества, используемые для измерения реакций, и, следовательно, дверцу инкубатора необходимо открыть примерно на 5 секунд. В дополнение к стабильности температур, обеспечиваемой этим устройством, исследователи института также высоко оценили быстрое время восстановления после открытия и закрытия дверцы. Чтобы предотвратить сильные изменения температуры, была установлена ​​стеклянная внутренняя дверь и специальная меньшая дверца (дверь в двери) (примерно 120x160 мм). Дверцы можно открывать по отдельности, сводя колебания температуры к минимуму.

Оборудование для лабораторий

от ведущих производителей Германии, Италии и Швейцарии
Посмотреть каталог

Появились вопросы? Оставьте заявку - мы Вам перезвоним!

Наши эксперты проконсультируют Вас и помогут выбрать подходящее оборудование для решения ваших задач